鴿子飛行能力基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用說明書
【賽鴿飛行能力鑒定試劑產品名稱】
通用名稱：鴿子飛行能力基因檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
【賽鴿飛行能力鑒定試劑預期用途】
本試劑盒用于鴿子飛行能力基因定性檢測，可對鴿子的飛行能力進行預測。
【賽鴿飛行能力鑒定試劑檢測原理】
根據鴿子飛行能力基因設計特異性引物和探針，利用熒光定量PCR技術，通過檢測熒光的釋放和強度，來檢測飛行能力基因。
【試劑盒組成】
本產品由特異性引物探針、Taq酶以及反應緩沖液組成。
【主要組成成分】
序號 | 組分 | 標示裝量/管 | 數量（管） |
1 | 10 x qPCR Buffer | 400ul | 1 |
2 | dNTP(2.5mM) | 240 ul | 1 |
3 | Hot Star Taq (5u/ul) | 30 ul | 1 |
4 | LDHA引物探針 | 200 ul | 1 |
5 | DRD4a引物探針 | 200ul | 1 |
6 | DRD4b引物探針 | 200ul | 1 |
【儲存條件及有效期】
-20℃避光保存有效期為12個月；切忌反復凍融。
【樣本要求】
1、羽毛：采集胸部或腹部或腿部羽毛2根，切忌使用自然脫落的羽毛。
2、全血：使用EDTA作為抗凝劑，切忌使用肝素抗凝。要求使用新鮮全血，或在2～8℃保存不超過7天，或在-20℃以下保存不超過一個月，應盡量避免反復凍融。
【檢驗方法】
1、樣本處理與核酸提取，具體操作參照相關操作說明書。
（1）0.2ml PCR管中，加入羽毛2-4根，加入Reagent A 20ul（注意淹沒樣本），99℃加熱20分鐘；
（2）向上一步的Pcr管中加入Reagent B 100ul，5000rpm離心30秒-1分鐘，備用；
2、儀器準備將每臺儀器接通電源，檢查是否運轉正常。
3、物品準備：離心機、冰盒、移液器、吸頭；試劑準備（未分裝規格使用）：將PCR反應液解凍、混勻，瞬時離心后分裝14μL/管。
序號 | 組分 | 用量 | 反應液 |
1 | 10 x qPCR Buffer | 2ul | 14ul反應液 |
2 | dNTP(2.5mM) | 1.6 ul | |
3 | Hot Star Taq (5u/ul) | 0.2 ul | |
4 | 去離子水 | 10.2 ul |
管號1 | 管號2 | 管號3 |
14ul反應液 | 14ul反應液 | 14ul反應液 |
4ul LDHA引物探針 | 4ul DRD4a引物探針 | 4ul DRD4b引物探針 |
2ul DNA模板 | 2ul DNA模板 | 2ul DNA模板 |
4、PCR擴增條件（反應體系為20μL）
擴增溫度 | 擴增時間 | 循環數 |
95℃ | 5min | 1 |
95℃ | 15sec | 40cycles |
60℃ | 30sec（采集熒光）FAM及VIC |
5、熒光定量檢測
結果判定
反應液 | 飛行能力基因基因型 | ||
野生基因型 | 雜合基因型 | 突變基因型 | |
管號1 LDHA基因 | GG | AG | AA |
管號2 DRD4a基因 | CC | CT | TT |
管號3 DRD4b基因 | CC | CT | TT |
FAM VIC信號判斷 | VIC＜33，FAM無ct | FAM-VIC絕對值＜3 | FAM＜33，VIC無ct |
備注 | FAM可能有ct，FAM-VIC絕對值＞5 | VIC可能有ct，FAM-VIC絕對值＞5 | |
【檢驗方法局限性】
本方法只適用于鴿子飛行能力基因檢測。
【產品性能指標】
1. 特異性：對特異性參考品進行檢測，所有參考品檢測結果陰性。
2. 準確性：對檢測范圍內的不同基因型的參考品進行檢測，能檢出相應基因型。
3. 最低檢出限：應不高于5ng/μL。
4. 重復性：檢測范圍內的不同基因型的重復性參考品，每個參考品進行10次檢測，結果能準確分型，且相應檢測結果Ct值的變異系數（CV）應≤5.0%。
5. 有效期：試劑盒于-20避光保存，有效期為12個月。
【注意事項】實驗前請仔細閱讀說明書
1.本試劑盒僅鴿子飛行能力基因體外檢測。有關實驗室管理規范嚴格按照行政主管部門頒布的有關基因擴增檢測實驗室的管理規定執行。
2.試劑盒應低溫運輸和保存，試劑盒內各試劑使用前，請短暫離心。
3.檢測時，提取樣本必須在生物安全柜中進行，且使用時要注意橫向污染。
4.實驗應嚴格分區操作：第一區：試劑制備區—準備擴增所需試劑；
第二區：樣本處理區—待測樣本和對照品處理；
第三區：PCR擴增區—PCR擴增檢測。
本產品為一次性用品，使用后的試劑盒和樣本等廢棄物應作為傳染源按照國家相關法律法規處理。
